大肠杆菌是生物医药领域中最常用的工程菌之一，其优势在于生长速度快、培养成本低以及基因克隆表达系统的成熟完善。这些特性使得其质粒常被用作基因工程中的载体，广泛应用于基因分子克隆、疫苗研发和重组蛋白类药物的生产等领域。然而，在这些生物制品中，内毒素的残留水平必须严格控制，以确保其安全性和有效性。

内毒素简介

内毒素是存在于革兰氏阴性菌细胞壁最外层的成分，主要由磷脂、糖类和蛋白质组成。其主要毒性成分是脂多糖（LPS）中的类脂A，内毒素只有在菌体死亡或被人工方法破坏时才会释放。内毒素对人体的影响显著，能够通过与宿主细胞上的Toll样受体（TLR）结合，激活炎性细胞和炎症因子，引发发热和全身性炎症反应，甚至导致严重的病理症状，如弥散性血管内凝血和多脏器功能衰竭。由于其具备极强的生物活性，即使微量内毒素亦能引发多种炎症反应。内毒素具有良好的耐热性和稳定性，通常需要在180℃高温下处理超过三小时时间才可完全灭活，普通化学药品对其也往往无效，只有强酸、强碱或强氧化剂能够破坏其结构。

内毒素的检测方法

内毒素的检测方法基于其与特定检测试剂的反应。常见的检测方法包括凝胶法、重组C因子法和动态比浊法。凝胶法利用鲎试剂中的C因子与内毒素结合并激活，从而启动血凝级联反应，通过观察凝集素形成判断内毒素的存在。这种方法操作简便，无需光学检测仪，但其检测范围可能存在局限性。随着鲎的保护以及重组技术的发展，新一代合成的重组C因子也开始应用于内毒素检测，其活化后能与荧光底物反应产生荧光信号，且信号强度与内毒素浓度成正比。此外，动态比浊法可以通过光学测定仪记录反应混合物达到预定光密度所需的时间及浊度变化速率，从而帮助追踪产品质量并提供风险预警。

内毒素的去除方法

鉴于内毒素对人体的显著危害，FDA等相关法规对其控制有明确要求。首先，应从源头消除外源性内毒素污染，在生物药物研发和生产过程中，与样品直接接触的设备、容器、原辅料等需经过严格的消毒和灭菌处理。对于内源性内毒素污染，则应在样品制备工艺中寻找合适的去除方法。常用的方法包括离子交换层析法、疏水层析法和特异性吸附法。

离子交换层析法利用产品与内毒素在缓冲液中的带电性质差异进行分离；阴离子交换层析通过改变缓冲液的离子强度使内毒素带大量负电荷，从而结合带正电荷的配基；阳离子交换层析则通过pH的调节使目的蛋白被吸附在离子交换介质上，实现分离。疏水层析法则是在高盐条件下使内毒素聚集，而样品不与填料结合，从而有效去除内毒素。特异性吸附法则通过将多粘菌素B偶联于层析介质，特异性去除内毒素，而不影响蛋白。在这些方法中，去除内毒素效果最佳，但可能导致一定的蛋白损失。

此外，还可以利用内毒素在不同水溶液中形成的聚集体的分子量差异，通过凝胶过滤层析和切向流膜过滤技术进一步去除内毒素。为了确保生物医药产品的安全性，尊龙凯时始终致力于开发有效的方法，以控制和去除内毒素，推动生物医药行业的健康发展。