ELISA，即酶联接免疫吸附剂测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是继免疫荧光法和放射免疫技术之后发展起来的一种重要免疫酶技术，广泛应用于生物医疗领域。作为检测抗原或抗体浓度的重要工具，ELISA实验通过化学反应使得无色底物转化为有色产物，从而达到检测目的。

在ELISA实验中，显色反应是在特定温度和时间条件下进行的，反应过程中温度和时间都会影响显色的效果。一般来说，阴性孔可在规定时间内保持无色，而阳性孔则会随着时间的延长变得颜色加深。适度提高反应温度可以有效促进显色的进行。定量测定时，加入底物后的温度和时间必须严格遵循规定；而定性测定的显色可以在室温下进行，通常对时间控制不必过于严格，适当延长或缩短时间可依据阴性与阳性对照孔的显色情况进行调整。

以OPD为底物的显色反应在室温或37℃下进行20-30分钟后，其显色程度通常不会继续加深。如果反应时间过长，可能会导致背景值的增高。此外，OPD底物在光照下会发生变色，故应避免在光照下进行显色反应。显色反应结束后应及时加入终止液，以停止反应。使用硫酸终止后，正产物的颜色会从橙黄色转变为棕黄色。

相较之下，TMB底物对光照的敏感性较小，可以在室温下进行反应并观察结果。但为了确保实验结果的一致性，推荐在规定的时间内读取结果。经过HRP催化后，TMB的显色在约40分钟内达到最高峰，随后会逐渐减弱并在2小时后消失。针对TMB，存在多种终止液，如叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS），这类酶抑制剂能有效维持蓝色反应的时间，通常可达12到24小时。酸性终止液则会使蓝色转变为黄色，此时应采用特定波长（450nm）进行吸光度测量。

在ELISA的检测过程中，待测样本中的抗原与固相载体表面的抗体反应。经过洗涤后，加入酶标记的抗体，进而通过新反应进行结合。之后加入底物后，底物被酶催化转换为有色产物，其生成量与待测物质量成正比，依靠显色的深浅可以进行定性或定量分析。

作为生物医学研究领域最常用的实验方法之一，ELISA的过程中可能会遇到多种问题。以下是对ELISA实验中标准曲线和样本显色相关问题的分析：

一、标准曲线不显色或显色很弱

样本显色液的溶解标准品和倍比稀释时，如果未进行充分的涡旋震荡，可能导致显色效果偏弱。在标准品溶解与倍比稀释时，都应确保充分混匀，仅依赖移液器的反复吹打效果较差。

二、标准曲线和样本均不显色

若在孵育阶段将样本静置在桌面，抗原与抗体之间的接触将变得不足，这会使显色效果不理想。此时建议使用ELISA专用微孔板振荡器，从而提高反应的结合效果。如果排除上述因素，则可能漏加了某个反应组分。

三、标准曲线显色，样本不显色

这种情况并不意味着试剂盒有问题。各种实验方法都有其局限性，当样本中目的蛋白浓度极低或存在干扰因素时，可能无法有效检测。目前，ELISA在蛋白检测方面仍然具有最高的灵敏度，通过与不同技术的结合，如高敏ELISA、化学发光ELISA等，显著提高了检测灵敏度。

四、标准曲线和样本均显色，但复孔CV较大

这个问题通常与移液器使用及实验者的操作习惯密切相关。建议关注移液器的规范使用和维护，同时在个人操作时间上进行练习，以提高移液的准确性和一致性。通过这些措施，可以有效减少实验结果中的变异。

综合来看，ELISA作为一种灵敏的生物检测方法，在尊龙凯时等品牌的优质试剂盒帮助下，能够更准确地进行生物样本的分析与检测，为生物医疗研究提供了有力的支持。